科瑞斯别藻蓝蛋白抗体标记方案【烟台科瑞斯】别藻蓝蛋白

一、别藻蓝蛋白简介

别藻蓝蛋白（APC）是从螺旋藻中分离的藻胆蛋白。与其他藻胆蛋白一样，别藻蓝蛋白是具有极高的吸收率和高量子效率的荧光物质。它是一种蛋白质，通过常规蛋白质交联技术可以很容易地与抗体和其他蛋白质连接，而不会改变其光谱特征。别藻蓝蛋白在主要的藻胆蛋白中是不稳定的，在低浓度下（包括某些实验浓度）易于解离。别藻蓝蛋白偶联物通常用于流式分析、基因芯片和ELISA实验，由于光淬灭特别快，很少用于荧光显微镜检测。

二、试验材料

别藻蓝蛋白染料 ；PD-10柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25M) ，Cytiva 公司产品，产品目录号 No. 17-0851-01；NAP5 柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25 DNA grade)， Cytiva公司产品，产品目录号 No 17-0853-02；琥珀酰亚胺-4-(N- 甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Thermo公司，产品目录号 No.22360；N-乙基马来酰胺（NEM），Thermo公司，产品目录号No.23030 ；二甲基亚砜（DMSO），Thermo 公司，产品目录号 No. D12345。

三、试验方法

1、别藻蓝蛋白的衍生化

①将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 毫克/毫升的母液，APC与琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯) (SMCC)交联摩尔比1：20，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟，使APC分子上的氨基与琥珀酰胺反应发生衍生化。

②交换缓冲液预先平衡凝胶层析柱，将衍生化的APC过柱，收集蛋白峰。

2、抗体的处理

①二硫苏糖醇（DTT）溶解于蒸馏水中，配制成 1 摩尔/升的二硫苏糖醇（DTT）母液，调整抗体的浓度，使其浓度至少为 4 毫克/毫升。

②每毫升抗体溶液中加入 20 微升的二硫苏糖醇（DTT）母液，室温静置反应 30 分钟，将抗体的二硫键打开形成巯基。

③交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将反应液过柱，收集抗体部分。

3、别藻蓝蛋白和抗体的共价交联

①每毫克抗体加入 1.5 毫克的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的APC，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟，使马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。（注：浓度需进行梯度测试，染料建议浓度4mg/mL）

②10 毫克的 N-乙基马来酰胺（NEM）溶解于 1.0 毫升的无水二甲基亚砜（DMSO）中制成 N-乙基马来酰胺（NEM）母液（现配现用）。

③每毫克抗体中加入 3.4 微升N-乙基马来酰胺（NEM）母液，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟， 反应后，使抗体上的巯基封闭。

4、交联物的存储

将交联物于存储缓冲液中透析后保存于2-8℃。

四、交联别藻蓝蛋白

由于提取的别藻蓝蛋白在稀释溶液（低浓度）或暴露于促溶盐环境中会水解，因此，通常对别藻蓝蛋白进行交联处理，从而使其在生物反应体系内保持稳定。利用化学方法对藻蓝蛋白进行处理，在α和β亚基之间发生化学交联,可以得到交联别藻蓝蛋白，即CL-APC。CL-APC比APC稳定得多不仅增强产品的稳定性，同时保留染料的荧光和光谱完整联别藻蓝蛋白的抗体标记方案与别藻蓝蛋白一致，标记后有更高的荧光强度。

科瑞斯生物可提供别藻蓝蛋白（APC）及更加稳定的交联别藻蓝蛋白（Cl-APC)，供客户选择。也可以提供已衍生化的别藻蓝蛋白，可减少实验步骤。

【联系方式】

座机：0535-3800305

手机：17362126717

地址：山东省烟台市高新区科技大道39号

邮箱：liuchuanyu@crystalbiosystems.com

网站：www.crystalbiosystems.com